離心(xin)機離心(xin)分離方(fang)法(fa)

更新(xin)時(shi)間(jian)：2016-03-02

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高(gao)速離心(xin)機的(de)幾(ji)種分(fen)離方(fang)法(fa)：

A.差速(su)離心(xin)：逐次增加離心(xin)力，每次(ci)可沈降樣(yang)品(pin)溶(rong)液(ye)中(zhong)的(de)壹(yi)些(xie)組(zu)份(fen)。

差(cha)速(su)離心(xin)是(shi)壹種zui常(chang)用(yong)的(de)方(fang)法(fa)。在這(zhe)種方(fang)法(fa)中，離心(xin)管在開(kai)始(shi)時(shi)裝滿(man)了均(jun)壹的(de)樣(yang)品(pin)溶(rong)液(ye)。通(tong)過(guo)在(zai)壹(yi)定(ding)速度(du)下壹(yi)定(ding)時(shi)間(jian)的(de)離心(xin)後，就可(ke)得到(dao)兩(liang)個部(bu)份：沈澱和上清液(ye)。

通(tong)常(chang)在(zai)*次(ci)離心(xin)時(shi)把大(da)部(bu)分不(bu)需(xu)要的(de)大(da)粒子(zi)沈降去掉。這(zhe)時(shi)所需(xu)的(de)組(zu)份大部(bu)分仍(reng)留(liu)在(zai)上(shang)清液(ye)中(zhong)。然(ran)後(hou)將(jiang)收(shou)集(ji)到(dao)的(de)上(shang)清液(ye)以(yi)更高(gao)速度(du)離心(xin)，把所(suo)需(xu)的(de)粒(li)子(zi)沈積下來。離心(xin)的(de)時(shi)間(jian)要選擇(ze)得當(dang)，使大(da)部(bu)份不(bu)需(xu)要的(de)更小(xiao)的(de)粒(li)子(zi)仍留(liu)在(zai)上(shang)清液(ye)中(zhong)。對(dui)於得(de)到(dao)的(de)沈澱和上清液(ye)可(ke)以(yi)進(jin)行進壹(yi)步(bu)的(de)離心(xin)，直到達到所(suo)需要的(de)分(fen)離純(chun)度(du)為(wei)止。

差速離心(xin)的(de)特(te)點是(shi)操(cao)作(zuo)簡單(dan)，但分離純(chun)度(du)不(bu)高(gao)。

B.密(mi)度(du)梯(ti)度離心(xin)法(fa)：可以(yi)同時(shi)使樣(yang)品(pin)中(zhong)幾(ji)個或(huo)全(quan)部(bu)組份(fen)分(fen)離，具(ju)有很好的(de)分(fen)辨率。

（1）速率(lv)區(qu)帶法(fa)（ratezonal）：

根(gen)據(ju)樣(yang)品(pin)中(zhong)不(bu)同粒(li)子(zi)所具(ju)有的(de)不(bu)同的(de)尺(chi)寸(cun)大小及(ji)沈降速(su)度（S）。大(da)致(zhi)步(bu)驟(zhou)如(ru)下：

在(zai)離心(xin)管中裝(zhuang)入密(mi)度(du)梯(ti)度溶(rong)液(ye)，溶(rong)液(ye)的(de)密(mi)度(du)從離心(xin)管頂部(bu)至底(di)部(bu)逐漸(jian)增加（正梯度）。

將所(suo)需分(fen)離的(de)樣(yang)品(pin)小(xiao)心(xin)地加至密(mi)度(du)梯(ti)度溶(rong)液(ye)的(de)頂(ding)部(bu)。樣品(pin)在(zai)梯(ti)度溶(rong)液(ye)表(biao)面(mian)形(xing)成(cheng)壹(yi)負(fu)梯度(du)。

由(you)於不(bu)同大(da)小(xiao)的(de)粒(li)子(zi)在離心(xin)力作用(yong)下，在(zai)梯(ti)度中(zhong)移動的(de)速(su)度不壹樣(yang)，所(suo)以(yi)經(jing)過(guo)離心(xin)後會形(xing)成幾(ji)條(tiao)分(fen)開的(de)樣(yang)品(pin)區(qu)帶。

註(zhu)意：樣品(pin)粒(li)子(zi)的(de)密(mi)度(du)必須大(da)於梯(ti)度(du)液(ye)註(zhu)中(zhong)任壹(yi)點的(de)密(mi)度(du)。離心(xin)過(guo)程(cheng)必須在(zai)區(qu)帶到(dao)達管子(zi)底(di)部(bu)前(qian)停(ting)止。

（2）等密(mi)度(du)離心(xin)法(fa)（isopycnic）：

根(gen)據(ju)粒(li)子(zi)的(de)不(bu)同密(mi)度(du)來分(fen)離。離心(xin)過(guo)程(cheng)中(zhong)，粒(li)子(zi)會移(yi)至與(yu)它(ta)本(ben)身(shen)密(mi)度(du)相(xiang)同的(de)地(di)方形成區(qu)帶。

密(mi)度(du)樣(yang)度的(de)選(xuan)擇(ze)要使梯(ti)度的(de)範(fan)圍(wei)包(bao)括(kuo)所(suo)有待分離粒(li)子(zi)的(de)密(mi)度(du)。樣(yang)品(pin)可(ke)以(yi)在(zai)密(mi)度(du)梯(ti)度液(ye)粒(li)上(shang)面(mian)或(huo)均(jun)勻分(fen)布(bu)在密(mi)度(du)梯(ti)度中。經(jing)離心(xin)後，樣品(pin)粒(li)子(zi)達到它(ta)們(men)的(de)平(ping)衡點。

註(zhu)意：平衡後(hou)粒(li)子(zi)的(de)分(fen)離*由(you)其密(mi)度(du)決(jue)定(ding)，與(yu)時(shi)間(jian)無關(guan)，此時(shi)再(zai)改變(bian)離心(xin)轉速(su)，只(zhi)能(neng)改變(bian)區(qu)帶的(de)相(xiang)對(dui)位(wei)置。

密(mi)度(du)梯(ti)度分析(xi)法(fa)

（1）梯度(du)介質(zhi)性質(zhi)與(yu)選擇(ze)：

A、應具(ju)備(bei)的(de)性質(zhi)：

梯(ti)度(du)物(wu)質(zhi)的(de)選(xuan)擇(ze)原則(ze)是(shi)滿(man)足分(fen)離方(fang)法(fa)的(de)基本(ben)要求(qiu)，壹(yi)個理(li)想的(de)密(mi)度(du)材(cai)料標準它(ta)應是(shi)：

所形(xing)成的(de)溶(rong)液(ye)密(mi)度(du)應(ying)包(bao)括(kuo)所(suo)需(xu)要的(de)密(mi)度(du)範(fan)圍(wei)。

具(ju)有某些(xie)性質(zhi)，如(ru)折(zhe)射(she)率(lv)，據(ju)此(ci)可(ke)測(ce)定(ding)它(ta)的(de)濃度(du)。

所(suo)形(xing)成(cheng)的(de)溶(rong)液(ye)粘度(du)低。

不損(sun)傷所(suo)分離的(de)樣(yang)品(pin)。

離心(xin)分離後(hou)容易除(chu)去。

不妨(fang)礙分離積分的(de)分(fen)析(xi)。

B、常用(yong)介質(zhi)種類(lei)：

表(biao)壹(yi)、常(chang)用梯度材料在20℃密(mi)度(du)

B.梯(ti)度介質(zhi)應(ying)用(yong)範(fan)圍(wei)：

表(biao)二、等密(mi)度(du)梯(ti)度介質(zhi)的(de)應(ying)用

表三(san)、各(ge)種大(da)分(fen)子(zi)在蔗(zhe)糖梯度(du)液(ye)中(zhong)的(de)大(da)約密(mi)度(du)

（2）、梯(ti)度溶(rong)液(ye)的(de)準備(bei)：

計算(suan),稀釋

（3）梯度(du)形狀

梯(ti)度(du)形狀(zhuang)分(fen)：線(xian)型、等速(su)型、階梯(ti)型、平坦型、陡峭型指數梯度。

梯度(du)形(xing)狀(zhuang)對(dui)於分(fen)離是(shi)否(fou)成(cheng)功非(fei)常重(zhong)要：

zui常用(yong)的(de)是(shi)線(xian)型梯度(du)，適(shi)用於分(fen)離蛋(dan)白(bai)質(zhi)、酶、激素(su)、核糖體(ti)亞基和壹些(xie)植(zhi)物病(bing)毒;等速(su)型適用(yong)於分(fen)離脂(zhi)蛋白(bai)和壹些(xie)需(xu)上(shang)浮分離樣(yang)品(pin);不(bu)連(lian)續(xu)或(huo)階(jie)梯型梯度(du)zui適(shi)用於分(fen)離整(zheng)細胞(bao)、亞細胞(bao)組(zu)分以(yi)及(ji)純(chun)化(hua)壹(yi)些(xie)哺(bu)乳(ru)類(lei)動物病(bing)毒或(huo)昆(kun)蟲(chong)病(bing)毒。等速(su)梯度(du)以(yi)及(ji)長液(ye)柱可(ke)增進分(fen)離能(neng)力，適(shi)用於分(fen)離核(he)糖體(ti)亞基、多核糖體(ti)及植(zhi)物病(bing)毒。

B.梯度(du)柱制(zhi)備(bei)：

梯度(du)液(ye)柱可(ke)以(yi)用(yong)手工(gong)或(huo)梯(ti)度儀制(zhi)備(bei)

半註(zhu)法(fa)：

為縮(suo)減(jian)離心(xin)時(shi)間(jian)，或(huo)分(fen)離樣(yang)品(pin)較(jiao)少可(ke)用(yong)半註(zhu)法(fa)：下半管(guan)鋪置(zhi)梯(ti)度(du)介質(zhi)，中(zhong)間(jian)加(jia)樣(yang)品(pin)，上(shang)面(mian)鋪Buffer或(huo)液(ye)體(ti)石(shi)臘(la)油(you)。

（4）加樣方法(fa)與(yu)加樣(yang)量：

將(jiang)樣品(pin)加(jia)到(dao)梯度液(ye)柱上(shang)，針尖和離心(xin)管成45-60°角(jiao)度，慢(man)慢(man)地將(jiang)樣(yang)品(pin)沿(yan)管(guan)壁流到(dao)液(ye)面(mian)上(shang)去，對(dui)於DNA壹(yi)類(lei)易斷的(de)脆(cui)弱(ruo)樣(yang)品(pin)，應(ying)該(gai)用孔徑(jing)較(jiao)大的(de)移(yi)液(ye)管(guan)代(dai)替(ti)針頭(tou)，以(yi)避免剪切力(li)對(dui)樣品(pin)的(de)切割作用(yong)。樣品(pin)濃度(du)是(shi)梯度(du)柱zui小(xiao)密(mi)度(du)的(de)1/10（W/W）。

（5）轉子(zi)的(de)選(xuan)擇(ze)與(yu)效(xiao)應(ying)：

（6）分(fen)離區(qu)帶的(de)回(hui)收(shou)及檢測(ce)

離心(xin)後所形(xing)成的(de)區(qu)帶樣(yang)品(pin)的(de)回(hui)收(shou)方法(fa)基本(ben)有四種：

a.穿(chuan)刺法(fa)

穿刺離心(xin)管底(di)部(bu)，使梯(ti)度(du)溶(rong)液(ye)滴(di)出，將壹(yi)具(ju)有合(he)適(shi)閥(fa)門的(de)蓋(gai)帽(mao)放(fang)在(zai)離心(xin)管頂，可(ke)控制(zhi)滴(di)出速度(du)。

b.虹(hong)吸(xi)法(fa)：

將壹(yi)毛(mao)細管(guan)輕(qing)輕(qing)插入(ru)管底(di)，盡(jin)量防(fang)止梯度抖動，用微量泵(beng)逐漸(jian)滴(di)取，以(yi)壹(yi)定(ding)量滴(di)數或(huo)體(ti)積部(bu)分收(shou)取。

c.加(jia)壓(ya)法(fa)：

通過(guo)壹(yi)針(zhen)管(guan)將(jiang)高(gao)密(mi)度(du)的(de)液(ye)體(ti)泵入(ru)到梯度離心(xin)管的(de)底(di)部(bu)，部(bu)分收(shou)集(ji)換(huan)出的(de)溶(rong)液(ye)。

d.切割法(fa)：

采(cai)用的(de)切割刀(dao)切割所需(xu)區(qu)帶。

區(qu)帶檢測(ce)：

所謂區(qu)帶檢測(ce)，實際上是(shi)對(dui)水平轉子(zi)或(huo)角(jiao)轉子(zi)和垂直轉子(zi)離心(xin)管中的(de)分(fen)離物(wu)質(zhi)所(suo)做的(de)監(jian)測(ce)，通常(chang)只(zhi)是(shi)測(ce)量在(zai)260或(huo)280mm時(shi)長的(de)吸(xi)收(shou)值，以(yi)決(jue)定(ding)梯度(du)中的(de)核(he)酸(suan)或(huo)蛋(dan)白(bai)的(de)整(zheng)個分布(bu)，這個操(cao)作(zuo)通(tong)常(chang)稱(cheng)之(zhi)為(wei)在線(xian)（online）監(jian)測(ce)。